Latest:
المقالات مقالات علمية 

رنين البلازمون السطحي: تقنية متعددة الاستخدامات لتطبيقات أجهزة الاستشعار الحيوية

الموقع الالكتروني

الاستاذ الدكتوره:ندى يحيى فيروز

ملخص

رنين البلازمون السطحي (SPR) هو أسلوب كشف لا يتطلب استخدام علامات، وقد برز خلال العقدين الماضيين كمنصة مناسبة وموثوقة في التحليل السريري للتفاعلات الجزيئية الحيوية. تتيح هذه التقنية قياس التفاعلات في الوقت الحقيقي بحساسية عالية ودون الحاجة إلى علامات. يناقش هذا المقال الاستعراضي مجموعة واسعة من التطبيقات في أجهزة الاستشعار البصرية باستخدام رنين البلازمون السطحي (SPR) أو تصوير رنين البلازمون السطحي (SPRI). نلخص هنا المبادئ، ونقدم أمثلة، ونوضح فائدة كل من SPR وSPRI من خلال تطبيقات عملية من مجالات الطب الحيوي، وعلم البروتينات، وعلم الجينوم، والهندسة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، تتناول هذه المراجعة استراتيجيات تضخيم إشارة الرنين البلازموني السطحي (SPR) وتعديل الأسطح.

  1. مقدمة

مقدمة: طُوِّرت استراتيجيات عديدة لوسم البروتينات، مما يسمح بتوصيفها من حيث بنيتها، أو طيها، أو تفاعلها مع بروتينات أخرى [1، 2]. تُستخدم استراتيجيات الوسم لربط علامات مُبلِّغة، مثل البيوتين، أو النظائر المشعة، أو الفلوروفورات، أو الإنزيمات، تساهميًا بالجزيئات الحيوية المستهدفة (أي البروتينات والنيوكليوتيدات) لتقييم الارتباط بين الجزيئات الحيوية كميًا [3، 4]. علاوة على ذلك، قد يُسبب استخدام العلامات الجزيئية إعاقة فراغية أو تغييرًا في التكوينات البنيوية، مما يؤثر على ألفة الجزيئات الموسومة للجزيئات الحيوية المستهدفة، وهو ما يُمثل تحديًا كبيرًا. يُغني الكشف غير الموسوم عن الحاجة إلى علامات أو أصباغ متخصصة، مما يسمح بالقياس الحساس

للمُحلَّلات المستهدفة، ويُمكِّن من استخدام الجزيئات الحيوية الأصلية المناسبة للمناهج ذات الصلة البيولوجية. خلال العقود القليلة الماضية، طُوِّرت مجموعة متنوعة من طرق الاستشعار الحيوي البصري، بما في ذلك رنين البلازمون السطحي (SPR) [5]، وميزان بلورات الكوارتز الدقيقة (QCM) [6]، وقياس الاستقطاب الإهليلجي [7]. ومن بين منهجيات الاستشعار البصري المختلفة، يُعد النظام القائم على رنين البلازمون السطحي (SPR) نموذجًا نموذجيًا للتقنية غير الموسومة لرصد التفاعلات الجزيئية الحيوية في الوقت الحقيقي. منذ ظهورها لأول مرة في أوائل التسعينيات، أثبتت تقنية رنين البلازمون السطحي (SPR) أنها من أقوى التقنيات لتحديد الخصوصية والتقارب والمعايير الحركية أثناء ارتباط الجزيئات الكبيرة بأنواع عديدة من الروابط، بما في ذلك روابط البروتين-بروتين [8،9]، والبروتين-DNA [10،11]، والإنزيم-الركيزة أو المثبط [4،12]، والمستقبل-الدواء [13،14]، والغشاء الدهني-البروتين [15،16]، والبروتين-السكريات المتعددة [17]، والخلية أو الفيروس-البروتين [18-20]، وغيرها. تقيس هذه التقنية البصرية تغيرات معامل الانكسار في محيط طبقات معدنية رقيقة (مثل أغشية الذهب أو الفضة أو الألومنيوم) استجابةً للتفاعلات الجزيئية الحيوية. قبل أن يتدفق محلول العينة عبر سطح SPR، تُثبَّت عوامل الالتقاط، مثل الأجسام المضادة والإنزيمات والببتيدات والحمض النووي DNA، على السطح. يمكن تحديد التغيرات في زاوية رنين البلازمون السطحي (SPR)، وهي زاوية الانعكاس الأدنى، عن طريق تغيير زاوية السقوط وتسجيل شدة الضوء المنعكس أثناء تفاعلات الارتباط البيولوجي بين الجزيئات الحيوية المختلفة. وقد ساهمت العديد من الدراسات في تعزيز إمكانات مستشعرات SPR من خلال زيادة فعالية هذه التقنية [21-23]. وبناءً على ذلك، توسعت مجالات تطبيق تقنية SPR لتشمل المجالات الطبية الحيوية والبيئية والصناعية. وكما هو موثق بشكل مكثف في الأدبيات العلمية، يُعد SPR طريقة مقبولة لتشخيص الأمراض، واكتشاف الأدوية، والكشف عن مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء، وغيرها [24، 25]. ويُعدّ تطبيق SPR في الأغراض الطبية الحيوية بارزًا. وقد طُوّرت حتى الآن أنواع مختلفة من أنظمة قياس SPR لرصد الأنواع الكيميائية والبيولوجية استنادًا إلى النظرية الأساسية لكشف SPR [26-28].
نستعرض هنا أحدث التطورات في مجال الاستشعار الحيوي بتقنية رنين البلازمون السطحي (SPR)، مع التركيز بشكل خاص على التطبيقات العملية لأجهزة الاستشعار الحيوية من نوع SPR، واصفين فوائدها والتحديات التي تواجهها في التحليلات الحيوية.

1.1 مبدأ عمل أجهزة الاستشعار الحيوية بتقنية SPR

المبدأ العام لتقنية SPR

يحدث رنين البلازمون السطحي عندما يصطدم فوتون ضوئي بسطح معدني (عادةً سطح ذهبي). عند زاوية سقوط معينة، يتفاعل جزء من طاقة الضوء عبر الطبقة المعدنية مع الإلكترونات الموجودة في الطبقة السطحية للمعدن، والتي تتحرك بدورها نتيجة الإثارة. تُسمى حركة الإلكترونات هذه بالبلازمون، وتنتشر بالتوازي مع السطح المعدني. يُولّد تذبذب البلازمون بدوره مجالًا كهربائيًا يمتد لمسافة 300 نانومتر تقريبًا من الحد الفاصل بين السطح المعدني ومحلول العينة [29]. في تصميم مستشعر حيوي تجاري بتقنية رنين البلازمون السطحي (SPR)، يُستخدم الضوء الساقط بواسطة موشور زجاجي ذي معامل انكسار عالٍ في هندسة كريتشمان لتقنية الانعكاس الكلي المخفف (ATR)

(الشكل 1). تعتمد زاوية رنين البلازمون السطحي المحددة، التي يحدث عندها الرنين، في ظل ثبات طول موجة مصدر الضوء ووجود سطح معدني رقيق، على معامل انكسار المادة القريبة من السطح المعدني. وبالتالي، عند حدوث تغير طفيف في معامل انكسار الوسط الحساس (مثلًا، نتيجة ارتباط الجزيئات الحيوية)، لا يمكن تكوين البلازمون. لذلك، يتم الكشف عن طريق قياس التغيرات في الضوء المنعكس الذي يتم الحصول عليه بواسطة كاشف. إضافةً إلى ذلك، يمكن تحديد كمية التركيز السطحي من خلال مراقبة شدة الضوء المنعكس أو تتبع تغيرات زاوية الرنين. عادةً، يبلغ حد الكشف لمستشعر SPR الحيوي حوالي 10 بيكوغرام/مل.

الشكل 1. مفهوم مستشعر الرنين البلازموني السطحي (SPR): (أ) هندسة كريتشمان لطريقة الانعكاس الكلي الموهن (ATR)؛ (ب) طيف الضوء المنعكس قبل وبعد تغيير معامل الانكسار؛ (ج) ارتباط عناصر التعرف الحيوي بسطح مستشعر SPR؛ (د) تغيرات معامل الانكسار الناتجة عن التفاعلات الجزيئية في وسط التفاعل. مقتبس من [30].

1.2 مبدأ تصوير SPR

في عمليات الفحص عالية الإنتاجية والتحليلات المتعددة، يوفر الجمع بين مصفوفات البروتين وتقنية SPR بديلاً ممتازًا وطريقةً خالية من الوسم مقارنةً بالطرق الحالية التي تتطلب بيانات حركية. مع ذلك، فإن أجهزة مستشعرات SPR القياسية، التي تحتوي على 3-4 خلايا تدفق على شريحة مستشعر واحدة، تُشكل عائقًا أكثر منها عونًا لتطبيقات الفحص عالي الإنتاجية (HTS). وللتغلب على هذه العقبة، تم تطوير نسخة معدلة من تصميم SPR، تُسمى تصوير SPR (SPRI)، لمعالجة مئات أو آلاف العينات في وقت واحد. تتمتع أنظمة التصوير بتقنية رنين البلازمون السطحي (SPR) التي تستخدم مصفوفات بصرية سريعة بإمكانيات تطبيقية واعدة في الفحص عالي الإنتاجية للأدوية والمؤشرات الحيوية، بالإضافة إلى التشخيص السريري من خلال استخدامها في أنظمة الكشف متعددة المصفوفات. تمثل تقنية التصوير بتقنية SPR خطوة هامة نحو الأمام في تحليل SPR. فبالإضافة إلى كونها لا تلغي الطريقة الحساسة الخالية من العلامات، تكمن القيمة المضافة لتقنية SPRI في قدرتها على تصوير شريحة حيوية كاملة عبر كاميرا CCD. يُمكّن التصميم المُحسّن من تحضير الشرائح الحيوية في شكل مصفوفة، حيث يمكن لكل نقطة في المصفوفة توفير كم هائل من معلومات SPR في آنٍ واحد.

كما هو موضح في الشكل 2، في نظام SPRI، يُستخدم شعاع ضوئي مستقطب متماسك بدلاً من الضوء متعدد الألوان. يُساعد هذا التغيير على توسيع نطاق تغطية الضوء على مساحة أكبر من سطح الاستشعار. يتم التقاط الضوء المنعكس بواسطة كاميرا CCD لإجراء المزيد من التحليل التصويري. توفر كاميرا CCD عالية الدقة صورًا عبر شكل المصفوفة في الوقت الفعلي لما يصل إلى مئات النقاط النشطة. يمكن للصور الملتقطة التي تُظهر التغيرات الموضعية على سطح الشريحة أن توفر معلومات تفصيلية عن الارتباط الجزيئي أو التفاعلات أو العمليات الحركية. على عكس تقنية SPR التقليدية، يتم إجراء القياس الذي يتم إجراؤه بواسطة SPRI بدقة عند طول موجي ثابت وزاوية ثابتة [32].
وبالتالي، تتناسب التغيرات في شدة الضوء المنعكس طرديًا مع أي تغير في معامل الانكسار بالقرب من سطح المعدن [33].

Reference
1.Stephanopoulos, N.; Francis, M.B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nat. Chem. Biol. 2011, 7, 876–884.

2.Tugarinov, V.; Kanelis, V.; Kay, L.E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nat. Protoc. 2006, 1, 749–754.

  1. Phelan, M.L.; Nock, S. Generation of bioreagents for protein chips. Proteomics 2003, 3, 2123–2134. 4. 5. 6. 7. 8.

4.Fong, C.-C.; Lai, W.-P.; Leung, Y.-C.; Lo, S.C.-L.; Wong, M.-S.; Yang, M. Study of substrate-enzyme interaction between immobilized pyridoxamine and recombinant porcine pyridoxal kinase using surface plasmon resonance biosensor. Biochim. Biophys. Acta 2002, 1596, 95–107.

5.Nelson, B.P.; Grimsrud, T.E.; Liles, M.R.; Goodman, R.M.; Corn, R.M. Surface plasmon resonance imaging measurements of DNA and RNA hybridization adsorption onto DNA microarrays. Anal. Chem. 2001, 73, 1–7.

6.Caruso, F.; Rodda, E.; Furlong, D.N.; Niikura, K.; Okahata, Y. Quartz crystal microbalance study of DNA immobilization and hybridization for nucleic Acid sensor development. Anal. Chem. 1997, 69, 2043–2049.

  1. Arwin, H.; Poksinski, M.; Johansen, K. Total internal reflection ellipsometry: Principles and applications. Appl. Opt. 2004, 43, 302
  2. Kim, M.; Park, K.; Jeong, E.-J.; Shin, Y.-B.; Chung, B.H. Surface plasmon resonance imaging analysis of protein-protein interactions using on-chip-expressed capture protein. Anal. Biochem. 2006, 351, 298–304.

9.Madeira, A.; Vikeved, E.; Nilsson, A.; Sjögren, B.; Andrén, P.E.; Svenningsson, P. Identification of protein-protein interactions by surface plasmon resonance followed by mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. 2011, 65, 19.21.1–19.21.9.

  1. Majka, J.; Speck, C. Analysis of protein-DNA interactions using surface plasmon resonance. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2007, 104, 13–36.
  2. Teh, H.F.; Peh, W.Y.X.; Su, X.; Thomsen, J.S. Characterization of protein—DNA interactions using surface plasmon resonance spectroscopy with various assay schemes. Biochemistry 2007, 46, 2127–2135.
  3. Geitmann, M.; Danielson, U.H. Studies of substrate-induced conformational changes in human cytomegalovirus protease using optical biosensor technology. Anal. Biochem. 2004, 332, 203–214.
  4. Salamon, Z.; Cowell, S.; Varga, E.; Yamamura, H.I.; Hruby, V.J.; Tollin, G. Plasmon resonance studies of agonist/antagonist binding to the human delta-opioid receptor: New structural insights into receptor-ligand interactions. Biophys. J. 2000, 79, 2463–2474.
  5. Rich, R.L.; Hoth, L.R.; Geoghegan, K.F.; Brown, T.A.; LeMotte, P.K.; Simons, S.P.; Hensley, P.; Myszka, D.G. Kinetic analysis of estrogen receptor/ligand interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 8562–8567.
  6. Baron, O.L.; Pauron, D.; Antipolis, S. Protein-lipid interaction analysis by surface plasmon resonance (SPR). Bio-Protocol 2014, 4, 1–8.
  7. Erb, E.M.; Chen, X.; Allen, S.; Roberts, C.J.; Tendler, S.J.; Davies, M.C.; Forsén, S. Characterization of the surfaces generated by liposome binding to the modified dextran matrix of a surface plasmon resonance sensor chip. Anal. Biochem. 2000, 280, 29–35.
  8. Beccati, D.; Halkes, K.M.; Batema, G.D.; Guillena, G.; Carvalho de Souza, A.; van Koten, G.; Kamerling, J.P. SPR studies of carbohydrate-protein interactions: Signal enhancement of low-molecular-mass analytes by organoplatinum(II)-labeling. Chembiochem 2005, 6, 1196–1203.
  9. Zhang, H.; Yang, L.; Zhou, B.; Wang, X.; Liu, G.; Liu, W.; Wang, P. Investigation of biological cell-protein interactions using SPR sensor through laser scanning confocal imaging-surface plasmon resonance system. Spectrochim. Acta. A. Mol. Biomol. Spectrosc. 2014, 121, 381–386.
  10. Besenicar, M.; Macek, P.; Lakey, J.H.; Anderluh, G. Surface plasmon resonance in protein-membrane interactions. Chem. Phys. Lipids 2006, 141, 169–178.